基因編輯技術(shù)在艾滋病毒研究中展現(xiàn)出前景

用于編輯基因的 CRISPR/Cas 系統(tǒng)的發(fā)展正在改變基因工程。1 , 2與 HIV 感染等疾病過程相關(guān)的生物途徑尤其令人感興趣。3 HIV 通過感染和破壞免疫系統(tǒng)細(xì)胞，特別是對哺乳動物適應(yīng)性免疫反應(yīng)至關(guān)重要的 T 細(xì)胞，對免疫系統(tǒng)造成嚴(yán)重?fù)p害。不同的研究實驗室開發(fā)了 CRISPR/Cas 基因編輯模型，試圖減少 HIV 感染。

CRISPR/Cas最初被發(fā)現(xiàn)是原核適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分。 CRISPR 代表成簇規(guī)則間隔的短回文重復(fù)，它們是包含堿基 DNA 序列短重復(fù)的原核 DNA 片段。重復(fù)序列由短間隔外源 DNA 分隔開，該外源 DNA 源自原核生物（細(xì)菌和古細(xì)菌）先前暴露于質(zhì)粒或噬菌體病毒。

CRISPR 與 CRISPR 相關(guān) (CAS) 基因協(xié)調(diào)發(fā)揮作用，使原核適應(yīng)性免疫系統(tǒng)能夠識別、響應(yīng)和消除外源 DNA。 CRISPR/Cas基因編輯被稱為分子剪刀，因為它本質(zhì)上是從原核生物基因組中剪掉外源DNA（質(zhì)粒和噬菌體）。原核生物中的 CRISPR/Cas 基因編輯類似于真核生物中的 RNA 干擾或基因沉默。

原核 CRISPR/Cas 機制被用來開發(fā)一系列豐富的編輯工具，例如用于哺乳動物細(xì)胞的 CRISPR/Cas9。 CRISPR/Cas9 有兩個主要組件：Cas9 和 RNA 向?qū)?，后者通過互補核苷酸結(jié)合將 Cas9 靶向特定的 DNA 片段。 Cas9 是一種核酸內(nèi)切酶，通過與向?qū)?RNA 結(jié)合，以序列特異性方式切割雙鏈 DNA。指導(dǎo) RNA 包含與目標(biāo) DNA 配對的核苷酸。

RNA 向?qū)Ы?jīng)過基因工程改造，可與選定的基因靶標(biāo)配對，并與 Cas9 一起遞送至細(xì)胞。當(dāng) RNA 引導(dǎo) Cas9 到達(dá)目標(biāo)基因組序列時，它允許 Cas9 在基因組中選定的目標(biāo)點切割兩條 DNA 鏈。然后可以在 Cas9 切割位點修改、插入或去除 DNA。

研究人員設(shè)計了 RNA 向?qū)碇笇?dǎo) Cas9 切割含有必需基因或長末端重復(fù)序列的 HIV 病毒 DNA 的不同區(qū)域。3 CRISPR/Cas9 基因編輯可顯著抑制各種研究細(xì)胞模型中的 HIV 病毒產(chǎn)生和感染，包括人類多能干細(xì)胞、原代 CD4+ T 細(xì)胞和 CD4+ T 細(xì)胞系。理論上，消除感染細(xì)胞中病毒表達(dá)所必需的HIV病毒DNA或基因應(yīng)該能夠滅活或消除HIV感染。

不幸的是，研究人員還在一些實驗中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞產(chǎn)生了 CRISPR/Cas9 抗性突變。當(dāng) Cas9 被引導(dǎo)切割時，這些突變聚集在病毒位點。 Cas9 無法切割目標(biāo)位點，因此 CRISPR/CAS9 攻擊無效。3 HIV 與其他病毒一樣，具有進(jìn)化出對其他攻擊機制（例如人類免疫系統(tǒng)和抗病毒的藥物）的抵抗力的能力。

在另一種對抗 HIV-1 感染的方法中，CRISPR/Cas9 已被用來消除趨化因子受體 5 型 (CCR5) 的表達(dá)。4CCR5 是一種輔助受體，某些 HIV 類型需要 CCR5 才能進(jìn)入 T 細(xì)胞并引起 HIV 感染。研究人員利用靶向 CCR5 的 CRISPR/CAS9 載體破壞了 CD34 陽性造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞中的 CCR5 基因。研究人員表明，CCR-5 突變克隆保留了分化為多種造血譜系的能力，并且很少引入脫靶突變。這很重要，因為安全性是基因編輯技術(shù)重要問題。因此，有必要證明經(jīng)過編輯的細(xì)胞仍然可以發(fā)揮作用，并避免意外的、可能有害的突變。 CRISPR/CAS 系統(tǒng)的成功和局限性的認(rèn)識都在推動優(yōu)化策略。

重要的是，突變 CCR5 的策略已在使用鋅指核酸酶 (ZFN) 的初步臨床醫(yī)學(xué)研究試驗中成功進(jìn)行了測試。 ZFN 與 CRISP/Cas 一樣，也是有前途的基因編輯分子剪刀工具，用于減少細(xì)胞中 HIV 的表達(dá)。 ZFN 是通過將 DNA 切割核酸酶結(jié)構(gòu)域與鋅指 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合而生成的。與 CRISPR/Cas 技術(shù)中使用的 RNA 向?qū)б粯?，鋅指結(jié)構(gòu)域可以被設(shè)計為靶向特定的 DNA。含有 Fok1 限制性酶的核酸酶結(jié)構(gòu)域是分子剪刀組件，可催化切割目標(biāo) DNA。 SB-728-T，也稱為 CCR5-ZFN，是一種研究性基因治療 ZFN 藥物（clinicaltrials.gov：NCT01543152、NCT01252641 和 NCT01044654）。

CCR5-ZFN 的機制基于 CCR5 的基因工程修飾，使 CCR5 失去功能，細(xì)胞對 HIV 感染具有更強的抵抗力。 CCR5-ZFN 試劑是從給定個體獲得的自體 T 細(xì)胞，例如 CD4+ T 細(xì)胞，通過鋅指核酸酶對 CCR5 基因進(jìn)行遺傳修飾，然后重新引入宿主生物體。修改后的 CCR5 基因座可能消除 HIV 進(jìn)入并感染 T 細(xì)胞的一個場所（CCR5 受體）。4 CCR5-ZFN/SB-728-T 用于研究以確定 CCR5 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞是否能夠抵抗 HIV 感染。研究人員還渴望確定 CCR5-ZFN/SB-728-T 是否可以將自身復(fù)制到其他耐藥細(xì)胞中，并通過阻止 HIV 進(jìn)入細(xì)胞來恢復(fù)受感染宿主的免疫細(xì)胞功能。

MyBioSource 提供以下用于基因編輯研究用途的產(chǎn)品：

• 人趨化因子受體 5 型 (CCR5)，ELISA 試劑盒（目錄號 #MBS2020083）

• CRISPR/Cas9，單克隆抗體（貨號#MBS375383）

• 化膿性鏈球菌 CRISPR 相關(guān)蛋白 9 核酸酶，重組蛋白（目錄號 #MBS140642）

• HIV（人類免疫缺陷病毒）ELISA 試劑盒（貨號#MBS766122）

• HIV-2 gp39，單克隆抗體（貨號#MBS430025）

• HIV Gp41/gg36，重組蛋白（貨號#MBS319756）

• HIV-1 p24，單克隆抗體（貨號#MBS8241470）

• HIV-1 Tat 相互作用蛋白 2 單克隆抗體 ELISA 試劑盒（產(chǎn)品目錄號 #MBS732587）