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分子克隆技巧簡介

更新時間:2024-01-03      點擊次數:641

分子克隆是分子生物學中用于組裝重組DNA分子的一組實驗方法。

基于質粒的克隆包括 4 個主要步驟:

  • 插入 DNA 制備

  • 載體DNA制備

  • 插入片段與載體的連接

  • 轉化為感受態(tài)細胞

在下面的示例中,我們將描述如何使用 SgfI 和 MluI 將目標插入片段亞克隆到載體中。
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插入 DNA 制備

  1. 對含有插入片段的載體進行限制性消化

    1. 用相應的限制性內切酶消化含有插入片段的載體 DNA。對于我們的示例,使用的限制性位點是 SgfI 和 MluI 位點。 OriGene 擁有全基因組 cDNA 表達載體

    2. 在瓊脂糖凝膠上運行消化的插入 DNA 以檢查大小并進行凝膠內純化。
      OTI-TIP:在瓊脂糖凝膠上運行純化的消化插入片段以確認濃度。濃度將進一步有助于建立連接。

  2. 從模板進行 PCR 擴增

    如果無法用兼容的限制性位點切割插入片段,則可以使用 PCR 來擴增插入片段,使其具有目標序列側翼的所需克隆位點。

    1. 設計包含目標序列側翼所需克隆位點的引物。免費的在線軟件程序可用于設計引物。如果手動設計,我們建議最小長度約為20bp,GC含量為40-60%,Tm為60-65°C。

    2. 通過 PCR 擴增模板中的插入 DNA。使用 PCR 純化試劑盒純化產物。

    3. 用限制性內切酶消化 PCR 產物。在瓊脂糖凝膠上運行消化的 PCR 并純化正確大小的 PCR 帶。
      OTI-TIP:在瓊脂糖凝膠上運行純化的 PCR 插入片段以確認濃度。濃度將進一步有助于建立連接。

載體DNA制備

  1. 選擇適合您的包含多個克隆位點 (MCS) 的克隆載體。 OriGene 擁有超過120 種哺乳動物表達載體,包括病毒和非病毒形式
    如果需要更多的載體DNA,可以使用熱休克或電穿孔方法轉化至大腸桿菌感受態(tài)細胞,例如DH5 alpha。

  2. 用與插入序列(例如 SgfI 和 MluI 位點)兼容的限制性酶消化 3-5 ug 載體。將限制性消化酶在 37°C 下孵育 1 小時。
    OTI-TIP:可能需要更長的孵育時間以確保載體全消化,但不要超過 3 小時。
    OTI-TIP:為防止載體自連接,請用堿性磷酸酶在 37°C 下將消化載體的 5' 末端去磷酸化 30 分鐘。

  3. 為了減少未切割的載體質粒背景,我們建議在瓊脂糖凝膠上運行消化的載體,然后純化線性載體。
    OTI-TIP:在瓊脂糖凝膠上運行純化的消化載體以確認濃度。濃度將進一步有助于建立連接。

結扎

  1. 為了成功連接,您可以使用載體:插入片段摩爾比為 1:3。
    OTI-TIP: 1:1 和 1:10 之間的載體:插入片段比例也可用于進一步優(yōu)化連接反應。

  2. 要確定自連接產生的任何背景克隆,請設置不含插入 DNA 的對照連接。

  3. 在 16 oC 下孵育過夜(或根據連接試劑盒中的方案)。

轉型

  1. 通過電穿孔或熱休克方法將 1-2 uL 連接反應轉化至大腸桿菌感受態(tài)細胞中。
    OTI-TIP:如果插入片段有毒或不穩(wěn)定,則可以使用專門允許這些插入片段成功擴增的感受態(tài)細胞。

  2. 轉移至 SOC 培養(yǎng)基中以復活轉化的細胞。在 37°C 下攪拌 SOC 介質 1-2 小時。

  3. 將混合物接種到裝有抗生素平板的 LB 上,并在 37°C 下孵育過夜。
    OTI-TIP:對于某些有毒插入物,可能需要較低的溫度和較長的孵育時間。較小的菌落可能是正確的克隆。

  4. 篩選帶有目標插入序列的質粒的集落。通過消化、PCR 擴增和測序確認


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