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Nanogold® 標(biāo)記試劑如何降低背景?

更新時(shí)間:2023-05-19      點(diǎn)擊次數(shù):607

減少背景染色有兩種方法:(a)在銀增強(qiáng)之前和期間修改實(shí)驗(yàn)條件;或(b)改善銀增強(qiáng)反應(yīng)的“停止"或在完成后應(yīng)用回顯影。

減少反應(yīng)過(guò)程中的背景

在使用熒光素和納米金®探針FluoroNanogold的組合實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)在銀增強(qiáng)之前用0.02 M檸檬酸鈉緩沖液(pH 7.0)洗滌,其背景明顯低于許多其他處理。當(dāng)使用Danscher銀增強(qiáng)劑進(jìn)行開(kāi)發(fā)時(shí),發(fā)現(xiàn)這是有效的。當(dāng)納米探針 總部銀色 使用0.02 M檸檬酸鈉緩沖液在銀增強(qiáng)前的pH 3.5下給予較低的背景。在免疫印跡中,我們發(fā)現(xiàn)銀增強(qiáng)前的0.05 M二鈉EDTA,pH 4.6也有助于最小化背景。

向Nanogold®孵育緩沖液中加入少量洗滌劑吐溫-20有助于防止疏水相互作用,這可能是非特異性結(jié)合的另一個(gè)來(lái)源。如果樣品可以耐受,用0.6 M三乙基碳酸氫銨緩沖液洗滌,其中納米金®是高度可溶的,也可以降低背景。

“停止"反應(yīng)和反向開(kāi)發(fā):

在大多數(shù)情況下,用去離子水或蒸餾水反復(fù)洗滌就足以停止銀增強(qiáng)過(guò)程。然而,它可能會(huì)在標(biāo)本內(nèi)繼續(xù)存在,這有時(shí)會(huì)在光學(xué)顯微鏡下導(dǎo)致過(guò)度顯影或深色外觀。在這種情況下,可以使用以下方法之一來(lái)“停止"銀增強(qiáng)反應(yīng):

  • 1%醋酸。

  • 1%醋酸,然后是照相定影劑(Agefix,Agfa-Gevaert或Ilfospeed 200,Ilford)。

  • 直接照片修復(fù),使用剛才提到的那些。

  • 用2.5%氯化鈉短暫沖洗。

  • 15-25%硫代硫酸鈉水溶液加15%亞硫酸鈉。

  • 1%乙酸,在乙酸鹽緩沖液中洗滌,在0.05%氯化氫中調(diào)色4 3-10分鐘,用3%硫代硫酸鈉除去多余的銀。我們發(fā)現(xiàn),在聚丙烯酰胺凝膠上運(yùn)行的納米金標(biāo)記蛋白質(zhì)在用10%乙酸和10%葡萄糖在水中停止時(shí)保持低背景,而不僅僅是水停止。

如果反應(yīng)進(jìn)行得太遠(yuǎn),可以通過(guò) Farmer 溶液(0.3 ml 7.5% 鐵氰hua鉀、1.2 ml 20% 硫代硫酸鈉、60 ml 水)處理來(lái)“反向顯影"以去除多余的背景染色.在金色調(diào)色之前將此溶液短暫地應(yīng)用于您的樣品可能有助于去除背景銀沉積。



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